基于双色单分子定位显微镜的分子分辨率成像

yedos

如下文献仅翻译前段，详细见附件。
单分子定位显微镜（SMLM）突破了衍射极限，显著提高了光学分辨率，为生命科学中复杂生物结构的成像提供了强大工具。然而，对10纳米以下的生物结构进行成像以及研究蛋白质 - 蛋白质相互作用，仍然是光学超分辨率显微镜面临的挑战。在此，我们介绍一种基于双色单分子定位显微镜的显微镜技术，我们称之为双色成像分子成像技术（MITI），它将分辨率提高到分子水平，达到几纳米。我们证明MITI适用于用有机染料和光激活/光开关荧光蛋白标记的样本。MITI能够分辨由长度为2 - 10纳米的单链DNA分隔的两种染料，以及与FtsZ的N端和C端融合的ffDronpa和PAmCherry1（ffDronpa - FtsZ - PAmCherry1）。MITI具有通用性且易于实现，因此，它将拓展分子尺度超分辨率显微镜在生命科学中的应用。

在过去的二十年里，光学超分辨率显微镜已成为实现生物结构高分辨率成像不可或缺的工具，在生命科学领域得到了广泛应用[1 - 3]。单分子定位显微镜（SMLM），如PALM、(d)STORM和DNA - PAINT等，能够超越光学衍射极限，实现亚10纳米尺度的分辨率[4 - 9]。然而，尽管这一分辨率代表了重大进展，但对于解析分子尺度的结构而言仍然不足，这限制了对大分子复合物和生物分子相互作用进行详细研究的能力[10 - 12]。为了克服这些挑战，实现观察分子尺度生物过程所需的分辨率，近期的研究重点在于开发创新方法，将光学显微镜的极限推向1纳米甚至亚纳米分辨率，标志着纳米显微镜时代的到来[13, 14]。例如，像MINFLUX、MINSTED、重复光学选择性曝光（ROSE）和SIMFLUX等技术，已有效地将空间分辨率提高到1 - 5纳米的范围[14 - 17]。然而，这些技术通常需要更复杂的光学和控制系统，这可能限制它们的可及性和广泛应用。因此，基于现有的成熟SMLM方法开发高分辨率成像技术仍然是一个有前景的方向。
该领域最近的一项突破是顺序成像分辨率增强技术（RESI），这是一种基于DNA - PAINT的方法，通过顺序成像有效提高了定位精度。RESI通过区分两种荧光分子的定位分布，并通过统计平均高精度计算它们的位置，实现了分子尺度的分辨率。从统计学角度来看，σRESI和σSMLM之间的关系可以描述为σRESI = σSMLM√K，其中K是来自同一单分子的定位总数。因此，如果K足够大，RESI的理论分辨率可能会非常高。然而，在细胞或组织中实施RESI存在几个挑战：

• 获取用于特定纳米结构的单链DNA标记抗体或纳米抗体可能具有挑战性，甚至不可行，因为并非所有生物分子都可以用DNA寡核苷酸标记。此外，这种标记方法比直接在感兴趣的蛋白质位点附着荧光团更具局限性，因为寡核苷酸无法穿过活细胞膜，并且需要从周围溶液中不断补充荧光团标记。此外，高电荷的DNA可能会影响分子构象，进一步限制其适用性[19, 20]。
• 顺序成像需要更换和清洗成像链，并对每一轮成像进行纳米级精度的对齐[8, 20]。这些步骤增加了成像时间并加剧了漂移，给分子尺度成像带来了重大挑战。
  

在这项研究中，我们介绍了双色成像分子成像技术（MITI），这是一种新颖的方法，它扩展了RESI的分辨率增强原理，但无需顺序成像。MITI不是依赖DNA - PAINT动力学，而是利用双色SMLM来提高定位精度，提供了一种更实用和广泛适用的方法。双色成像具有几个优点：

• 它具有通用性，与PALM、STORM和DNA - PAINT等成熟技术兼容[22 - 24]。
• 它不需要迭代成像周期，避免了漂移和复杂样本制备的缺点。
  

为了验证我们方法的可行性，我们首先进行了数值模拟。我们的研究结果表明，我们的技术可以实现分子尺度的分辨率，主要限制因素是来自单个分子的定位总数。接下来，我们使用用有机染料Cy3和Cy5标记的单链DNA（ssDNA）对MITI进行了实验测试，其中荧光团之间的距离为2 - 10纳米。我们的结果表明，MITI成功分辨了10纳米以下的距离。最后，我们将MITI应用于与光开关/光激活荧光蛋白融合的细菌分裂蛋白FtsZ（ffDronpa - FtsZ - PAmCherry1），预期的结构分离约为5纳米。我们的成像结果证实，MITI有效地解析了这些分子尺度的结构[26 - 28]。
总之，MITI为分子尺度的光学成像和距离测量提供了一种通用且实用的工具，解决了现有超分辨率技术相关的关键挑战，同时与广泛使用的SMLM方法保持兼容。通过在不进行复杂顺序成像程序的情况下实现纳米甚至亚纳米分辨率，MITI有可能对生命科学产生重大影响。
英文原版：