石墨烯的特性为三维成像增加了轴向分辨率精度

慕尼黑，2023年3月14日- -慕尼黑路德维希·马克西米利安大学( LMU )的研究人员将脉冲交错MINFLUX ( pMINFLUX )纳米显微镜与新开发的轴向分辨率方法相结合，利用二维材料石墨烯的特殊性质，实现了纳米级精度的三维超分辨率成像。研究人员将pMINFLUX的2D定位与石墨烯能量转移( GET )的轴向信息相结合，并与利用DNA点积累进行纳米形貌成像的单分子开关( DNA-PAINNT )相结合。

DNA - PAINT是一种单分子定位显微技术，支持高空间分辨率的荧光标记分子的多重成像。

利用该方法，团队实现了小于2 nm的三维定位精度，轴向精度小于0.3 nm。通过实现分子甚至亚分子分辨率，具有纳米精度的3D超分辨显微成像将为纳米结构和生物系统提供新的见解。pMINFLUX和GET的协同组合允许在近表面进行超分辨成像，例如用于研究细胞粘附和膜复合物。

PMINFLUX是由LMU实验室于2020年推出的MINFLUX (最小光子FLUX)的简化版，它本身结合了单分子定位显微镜和受激发射损耗显微镜两个方面的超分辨成像方法。pMINFLUX除了比构建它的方法简单外，还提供了荧光寿命。

MINFLUX通过将激光聚焦在分子附近，根据荧光强度测量分子距离激光焦点中心的距离来询问每个分子的位置。研究人员可以通过将激光焦点的中心放置在与分子相关的不同连续位置来获得分子的精确位置。

当pMINFLUX和GET相结合时，每个光子的信息可以同时用于二维和轴向定位信息。通过使用DNA折纸纳米定位器、荧光分子和DNA - PAINT在3D中精确地放置结合位点。然后利用纳米定位器评估GET、pMINFLUX和DNA - PAINT的组合在距离石墨烯不同距离的三维定位和三维超分辨成像。

由于GET的使用，荧光寿命具有距离依赖性；因此，荧光寿命的变化可以转换为与石墨烯的轴向距离。

这使得GET - pMINFLUX能够提供轴向精度小于3 Å的三维定位。

菲利普·廷尼菲尔德教授说："利用pMINFLUX和石墨烯的结合，光子的信息得到了最好的利用。在这里，pMINFLUX与石墨烯能量转移( GET )协同结合，实现了迄今为止荧光显微镜无法达到的精度。

( a ) pMINFLUX用多个空间位移的甜甜圈光束询问荧光团的位置，产生具有纳米精度的二维荧光寿命图像。( b )石墨烯提供了对石墨烯轴向距离的度量。荧光团越靠近石墨烯，荧光寿命越短。( c )结合pMINFLUX的横向信息和轴向石墨烯距离信息，实现了三维定位。GET - pMINFLUX产生具有纳米精度的光子有效定位。这使得L - PAINT成为可能。DNA折纸结构的示意图具有一个突出的DNA指针。通过结合L - PAINT和GET - pMINFLUX，这种致密的结构在2 s内以纳米精度和3D方式被定位。J . Z ä hringer等

PMINFLUX在xy中具有超高的定位精度；利用pMINFLUX的荧光寿命信息，GET协同提供了靠近盖玻片表面的z定位；和DNA - PAINT提供了从超局域化到超分辨的切换机制。这三个互补成分综合利用了被探测到的每个光子的信息。据研究人员介绍，每个组件都可以比较容易地实现。

研究人员Jonas Z ä hringer说：" GET - pMINFLUX所能达到的高精度使人们能够在方法学上开发新的方法来改善以前无法实现的超分辨率显微镜。"通常，需要染料的整个光子预算来定位1 - nm精度的位置。然而，GET - pMINFLUX是如此的光子效率，以至于光子预算可以在多个位置之间分割，并且仍然产生纳米精度的定位。

为了克服pMINFLUX视场较小和DNA - PAINT结合动力学受限的问题，研究人员利用DNA纳米技术开发了局部PAINT ( L-PANT )。与DNA - PAINT通过结合和解离荧光染料标记的DNA链实现超分辨不同，L - PAINT具有两个结合序列。研究人员设计了一个结合层次，其中L - PAINT DNA链在一侧结合更长时间。这使得链的另一端可以扫描具有高局部浓度的结合位点。研究人员通过在几秒钟内成像一个边长为6 nm的三角形结构来展示L - PAINT。

Tinnefeld说，GET - pMINFLUX和L - PAINT的结合使我们能够在分子水平上研究结构和动力学，这对于我们理解细胞生物分子反应是至关重要的。

未来，GET - pMINFLUX纳米显微镜可用于研究人工双分子层、细胞膜、粘附复合物以及大分子复合物，具有纳米尺度、3D精度。

该研究发表在Light：Science & Applications ( www.doi.org / 10.1038 / s41377-023-01111-8)上。