什么是暗场显微镜？

Alec De Grand， 2020/12/17

What Is Darkfield Microscopy? | Olympus LS (evidentscientific.com.cn)

  暗场显微镜是一种利用倾斜照明来增强样品在正常照明条件下成像不佳的对比度的技术。

  在直射光被聚光镜中的不透明光阑遮挡后，从倾斜角度穿过样品的光线被衍射、折射并反射到显微镜物镜中，以形成叠加在深色背景上的标本的明亮图像。

  这种深色背景提供了高对比度，并且可以使具有复杂背景的标本以相对较少的工作量脱颖而出。查看下图中的一些示例。

右：蚕幼虫螺旋和螺旋纹管。在暗场条件下用透射光显微镜照射时，碎片状木屑呈现出异常美丽的外观。

左：蝴蝶。蝴蝶，由于该目成员表现出的翅膀鳞片图案的广谱，是昆虫世界中最丰富多彩的成员之一。数字图像显示了装饰蝴蝶翅膀大部分表面的许多微型鳞片。翅膀鳞片用暗场子级聚光镜照射，并以低放大倍率（50x）捕获。

暗场显微镜如何工作？

  暗场照明需要阻挡通常穿过标本和标本周围的大部分光线，只允许倾斜光线与标本相互作用。

  一个简单的阿贝暗场聚光镜的顶部透镜是球形凹面的，允许从顶部透镜表面出现的光线形成一个倒置的空心锥形光，焦点集中在标本平面上。在没有样品且聚光镜的数值孔径大于物镜的地方，倾斜光线会相互交叉并错过物镜，使这些区域变暗。

  当将标本（特别是未染色的、不吸光的标本）放在载玻片上时，倾斜光线会与标本相互作用，并被样品中的元素（如细胞膜、细胞核和内部细胞器）衍射、反射和/或折射。这允许这些微弱的光线进入物镜，就能呈现出黑色背景上的明亮标本。

暗视野显微镜需要哪些组件？

  几乎任何明场实验室显微镜都可以轻松转换以进行暗场照明。最简单的方法是用专为暗场照明设计的聚光镜关闭当前的聚光镜（图1）。

  这些聚光镜相对简单，并提供创建暗场的锥形照明所需的高数值孔径（NA）。然而，基于照明类型切换聚光镜对于日常显微镜使用是不切实际的。幸运的是，有一个解决方法。

  许多聚光镜可以容纳能产生锥形照明的内插件。这些内插件的数值孔径不能像专用暗场聚光镜那样高，因此并非所有物镜都可以使用。但是，内插件使您可以灵活地在同一聚光镜上使用多种观察方法。

图 1.专为暗场照明而设计的聚光镜

为什么暗场显微镜是一种很好的成像技术？

  一般来说，在适当的暗场照明条件下成像的物体非常壮观。通常，在明场显微镜中固有对比度非常低的标本在暗场中闪耀出明亮的光芒。

  暗场照明最适合显示轮廓、边缘、边界和折射率渐变。暗场照明的理想适用对象包括微小的活水生生物、硅藻、小昆虫、骨骼、纤维、头发、未染色的细菌、酵母、组织培养中的细胞和原生动物。

  非生物标本包括矿物和化学晶体、胶体颗粒、粉尘计数标本以及含有小夹杂物、孔隙率差异或折射率梯度的聚合物和陶瓷薄片。

以下是使用暗场成像捕获的标本的一些示例：

左图：这张壮观的暗场硅藻埃伦贝吉斯暗场显微照片是由莫蒂默·阿布拉莫维茨在奥林巴斯显微镜下拍摄的。用高数值孔径暗场聚光镜照射标本，在显微镜载玻片与物镜和聚光镜前透镜之间放置浸没油。

中间：椴木。染色的标本通常是暗场显微镜的绝佳候选者，产生在深色背景上以彩色呈现的美丽图像。这张显微照片描绘了一棵椴树在暗场照明下的染色薄片。

右图：液晶核糖核酸。这种高度浓缩的DNA溶液经历了一系列的液晶相变，形成了密集堆积的六角相。该显微照片是在暗场照明下使用复合光学显微镜的10倍物镜拍摄的。

不幸的是，暗场照明对于揭示内部细节不太有用。如果您想充分利用暗场照明，还需要考虑其他条件。

使用暗场显微镜的挑战是什么？

  在为暗场显微镜准备标本时必须小心，因为位于焦点平面上方和下方的特征会散射光并导致图像退化。在成像时，载玻片的清洁度是一个重要因素，但在暗场中更为重要，因为每一块碎片都会被照亮，并可能带走您想要看到的东西。

  在设置暗场显微镜时，您可能面临的其他挑战包括：

· 照明不足以使标本可见，或者试样可见但非常微弱。

  暗场显微镜需要大量的光线才能正确成像，因为其中很多光线都被阻挡以形成锥体。因此，不要犹豫，打开电源，但请注意，有些样品可能不喜欢长时间照在它们上面的光量。

· 载玻片在视野中心有一个黑点，但外围的物体照明良好，看起来正常。

  这通常是在聚光镜未正确对准或聚焦时引起的。对聚光镜进行对中和聚焦能解决这个问题。这个操作适用于照明不均匀但样品在焦点处的大多数问题。

· 颜色显示在背景中，或者背景不均匀地亮起，并带有灰色色偏。

这通常是由于样品太厚或安装在受污染的介质中造成的。重新装入样品应该会有所帮助。

使用暗场显微镜的优势是什么？

  暗视野显微镜具有许多优点。其深色背景提供了高对比度，可以很容易地在复杂的背景上看到标本。这种技术很容易实现，因为许多明场实验室显微镜可以配置为暗场照明。除了显微镜的好处之外，暗场图像甚至可以看起来像艺术品，样品被精美地照亮。